新維創(chuàng)生物今日分享-熒光染料基本知識(shí)

通過染料的熒光，可以從復(fù)雜的生物體中選擇性觀察某個(gè)特定的細(xì)胞器官或者蛋白，比如觀察活細(xì)胞中的線粒體結(jié)構(gòu)，具有很高的靈敏度和選擇性。熒光染料是生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中非常常用的工具，了解它們的基本原理對(duì)靈活使用這個(gè)工具非常重要，在這新維創(chuàng)生物主要分享一些熒光染料的基礎(chǔ)知識(shí)。

1、熒光染料發(fā)光原理：

熒光染料大部分都是帶多個(gè)芳香環(huán)的有機(jī)分子，顏色較深，因此可以吸收特定波長(zhǎng)的光，這個(gè)光即染料的激發(fā)光。吸收激發(fā)光后，染料分子的分子能量增加，處于激發(fā)態(tài)（S1’）。激發(fā)態(tài)能級(jí)高，并不是一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)，因此有機(jī)分子一般通過化學(xué)鍵旋轉(zhuǎn)或者震動(dòng)釋放能量回到基態(tài)（S0），但是染料分子結(jié)構(gòu)特殊，在通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)釋放部分能量到達(dá)某個(gè)特定能級(jí)（S1）后，直接跳到基態(tài)，同時(shí)將剩余的能量以光子的方式釋放出來，即發(fā)出熒光。由于熒光光子在發(fā)射前已經(jīng)通過分子運(yùn)動(dòng)損失了部分能量，所以熒光的光子能量比激發(fā)光低，最終表現(xiàn)為波長(zhǎng)比激發(fā)光長(zhǎng)（波長(zhǎng)越短能量越高），即光譜紅移。比如FITC的激發(fā)光最高峰（Em）為494nm，而它的發(fā)射光最高峰（Ex）為520nm。

染料激發(fā)和熒光發(fā)射是可以不斷循環(huán)的，只要染料的熒光核化學(xué)結(jié)構(gòu)在這個(gè)過程中不被破壞（即光漂白，熒光核的化學(xué)結(jié)構(gòu)在處于激發(fā)態(tài)高能級(jí)時(shí)偶爾引起化學(xué)鍵斷裂或者化學(xué)反應(yīng)，使染料無法再發(fā)熒光），染料可以不斷的發(fā)射熒光。一個(gè)染料分子可以發(fā)射幾萬次、幾十萬次熒光，這個(gè)也是熒光染料顯影靈敏性高的基礎(chǔ)。

2、Ex/Em激發(fā)峰和發(fā)射峰

染料可以被一定寬度波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光激發(fā)，染料激發(fā)時(shí)最高吸收峰波長(zhǎng)就是激發(fā)峰，同樣發(fā)出的熒光也是一個(gè)寬泛范圍的熒光，最強(qiáng)的熒光波長(zhǎng)即是發(fā)射峰。染料用激發(fā)峰波長(zhǎng)的光照射時(shí)熒光最強(qiáng)，同樣，在發(fā)射峰左右檢測(cè)光信號(hào)時(shí)，最明亮最靈敏。每種染料都有特定的Ex/Em值，但是在不同溶劑（水溶劑 vs 有機(jī)溶劑）中，測(cè)得的Ex/Em值可能會(huì)不一樣，另外不同儀器上測(cè)量可能會(huì)有輕微偏差。我們列出的Ex/Em值都是以生物實(shí)驗(yàn)條件，一般為PBS或者TBS中測(cè)得。

3、Stokes位移

英文為Stokes shift，Stokes位移是指吸收光譜波峰（Ex）和熒光發(fā)射光譜波峰（Em）之間的峰位差值。熒光光譜與激發(fā)光譜相比，將向能量較低的方向偏移（紅移），Stokes位移反應(yīng)的實(shí)際上是兩個(gè)光子能量的差值，能量的差值主要是由于化學(xué)鍵旋轉(zhuǎn)振動(dòng)的熱損耗。不同染料的Stokes位移差別很大，比如BODIPY染料Stokes位移只有10nm左右，Cy系列染料有20-30nm，有個(gè)染料比如GelRed可以達(dá)到200-300nm之多。染料Stokes位移的大小對(duì)我們熒光實(shí)驗(yàn)是激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)選擇會(huì)有一些影響，如果Stoke位移比較?。ū热鏐ODIPY染料），我們不能使用Ex/Em波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)和檢測(cè)，避免它們太近發(fā)生干擾。

4、消光系數(shù)

英文為Extinction coefficient，常用ε表示。中文有時(shí)候也叫摩爾吸收光系數(shù)，指的是當(dāng)特定波長(zhǎng)的單色光（熒光染料一般用最大激發(fā)波長(zhǎng)Ex）通過1cm光程的比色皿溶液時(shí)，1 mol/L濃度的染料的吸光度值。任何染料的消光系數(shù)都是它的固定參數(shù)，可用來計(jì)算染料的濃度。比如，我們將某個(gè)未知濃度的染料標(biāo)記樣品測(cè)定Ex波長(zhǎng)下的吸收值A(chǔ)后，可用公式 conc = A / ε 計(jì)算得到準(zhǔn)確的染料濃度，這是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的、很準(zhǔn)確的濃度測(cè)定方法。當(dāng)然，在測(cè)定吸收值A(chǔ)時(shí)，你需要將樣品稀釋到合適的程度，不要讓讀數(shù)超過分光光度計(jì)的測(cè)量范圍。

消光系數(shù)和染料的熒光亮度有關(guān)。染料的熒光亮度與消光系數(shù)和量子產(chǎn)率都成正比關(guān)系。這個(gè)很容易理解，消光系數(shù)其實(shí)反映的是染料在最大激發(fā)波長(zhǎng)Ex下對(duì)光的吸收能力，消光系數(shù)越高，吸收能力越強(qiáng)，染料獲得能量越高，發(fā)射的熒光光子越多，熒光越亮。我們可以看一下下面幾種染料的消光系數(shù)。不同染料之間消光系數(shù)差距很大。

5、量子產(chǎn)率

英文為Fluorescence quantum yield (QY)，常用Φ表示。染料分子吸收激發(fā)光能量到達(dá)激發(fā)態(tài)，通過機(jī)械振動(dòng)釋放部分能量到達(dá)S1態(tài)，然后發(fā)射一個(gè)熒光光子跳躍到基態(tài)，完成一個(gè)循環(huán)，但是有一部分染料分子在S1態(tài)時(shí)并不發(fā)光跳躍到基態(tài)，而是繼續(xù)化學(xué)鍵旋轉(zhuǎn)或者振動(dòng)的方式釋放能量，直到到達(dá)穩(wěn)定的基態(tài)。因此，我們可以看到，熒光染料吸收光子激發(fā)后不會(huì)釋放等數(shù)量的熒光光子。熒光量子產(chǎn)率就是指激發(fā)態(tài)染料分子中通過發(fā)射熒光而回到基態(tài)的分子占全部激發(fā)態(tài)分子的分?jǐn)?shù)。量子產(chǎn)率最高為1，即每個(gè)激發(fā)態(tài)染料分子都會(huì)發(fā)一個(gè)熒光光子。染料分子的量子產(chǎn)率差別很大，比如熒光素的量子產(chǎn)率可達(dá)0.95，而Cy5的量子產(chǎn)率才0.2，部分近紅外染料的量子產(chǎn)率更是低至 <0.1。大部分熒光染料的量子產(chǎn)率在0.3-0.6之間，但是實(shí)際的產(chǎn)率會(huì)因?yàn)闊晒獯銣绲仍虻鸵恍?。另外，量子產(chǎn)率也和溶劑種類，pH等多種因素有關(guān)，比如熒光素在乙醇中的量子產(chǎn)率為0.79 cm-1M-1，而在0.1N NaOH溶液中時(shí)為0.95 cm-1M-1。

6、熒光亮度

英文為Fluorescence brightness。熒光染料的初始亮度由兩個(gè)因素決定：消光系數(shù)（ε）和量子產(chǎn)率（Φ）。ε是指染料分子吸收激發(fā)光的能力有多強(qiáng)，而Φ是指將這些吸收的激發(fā)光能力轉(zhuǎn)化為熒光的效率有多高。熒光染料的初始亮度可以用這個(gè)公式表示：Brightness = Extinction Coefficient (ε) x Fluorescence Quantum Yield (Φ)。

PE = 1,960,000 cm-1M-1 x 0.84 = 1,646,400

APC = 700,000 cm-1M-1 x 0.68 = 476,000

Cy5 = 250,000 cm-1M-1 x 0.20 = 50,000

我們可以看到PE比APC明亮，APC比Cy5明亮。在這里，PE和APC是蛋白質(zhì)類熒光染料，Cy5是小分子類熒光染料。另外我們需要注意到一點(diǎn)，所有這些亮度計(jì)算的都是初始亮度，就是染料剛剛被照射時(shí)的亮度，隨著激發(fā)光照射的時(shí)間延長(zhǎng)，染料會(huì)慢慢發(fā)生光漂泊現(xiàn)象（Photo bleaching）失去發(fā)熒光能力，因此在使用過程中，熒光信號(hào)會(huì)越來越弱。這個(gè)現(xiàn)象在熒光素，F(xiàn)ITC等特別容易光漂泊的染料中非常明顯。顯微鏡下，熒光素標(biāo)記的樣品綠色熒光會(huì)很快越來越弱，往往半分鐘就非常暗淡了。

另外，我們?nèi)庋塾^測(cè)、感覺到的熒光亮度還以熒光顏色有關(guān)，一般綠色和紅色肉眼會(huì)感覺更明亮一些，對(duì)于CCD相機(jī)，主要檢測(cè)光子流量，不會(huì)有這些差別。

7、熒光淬滅

英文為Fluorescence quenching。熒光猝滅是指熒光染料由于分子聚集，或者它們之間距離過近，互相干擾，而使發(fā)出的熒光信號(hào)變?nèi)踹@一現(xiàn)象。熒光淬滅是一個(gè)可逆的過程，就是說如果將分子之間距離拉大，它們的熒光又會(huì)變強(qiáng)。這一點(diǎn)是它和熒光漂白的不同，熒光漂白是一個(gè)不可逆的過程，染料分子漂白后，分子結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，分子無法再發(fā)出熒光。熒光猝滅主要出現(xiàn)在這些情況下，比如染料分子不溶，或者染料分子濃度過高，或者染料分子標(biāo)記到大分子表面的密度過大。

在大分子的熒光染料標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)需要考慮熒光淬滅現(xiàn)象。標(biāo)記時(shí)需要控制大分子/染料的比例，不要過度的標(biāo)記，大分子表面標(biāo)記過多染料會(huì)使染料分子之間的距離過近，從而引發(fā)熒光淬滅，最后的過標(biāo)記產(chǎn)物熒光反而不強(qiáng)。另外，需要注意的是熒光淬滅并不是熒光信號(hào)沒有了，而是比預(yù)想的低，所以淬滅條件下的染料分子仍然可以發(fā)出熒光，只是比較弱而已。利用熒光淬滅現(xiàn)象，可以開發(fā)很多熒光探針。比如下圖所示探針檢查到目標(biāo)產(chǎn)物后發(fā)生形變，兩頭的染料分子距離變大，淬滅現(xiàn)象消失，熒光增強(qiáng)。

8、背景熒光

背景熒光，是熒光實(shí)驗(yàn)時(shí)的噪聲，指在圖像中觀察到、但又不希望它出現(xiàn)的熒光信號(hào)。背景熒光有許多來源，在這里主要討論來自樣品的背景熒光。背景熒光可能來自于樣品沒有洗脫掉非特異性吸附的染料或者干擾性物質(zhì)（這個(gè)情況比較好處理，只需要改善洗滌條件就可以了），更多的情況是來自于樣品自帶的熒光。所有的物質(zhì)在強(qiáng)光照射下都會(huì)發(fā)出非常微弱的熒光，因此在我們所需要觀測(cè)的樣品熒光信號(hào)比較微弱的情況下，背景熒光會(huì)非常明顯。一般情況下，藍(lán)光或者綠光的背景熒光比較明顯，隨著熒光波長(zhǎng)紅移，生物樣品的背景熒光越來越弱，所以，對(duì)于背景熒光干擾大的樣品，選擇紅色熒光或者近紅外熒光染料會(huì)更好一些。另外，也可利用特殊試劑處理生物樣品，降低背景熒光。